■ 信号分子（signal molecules）

　　细胞通讯的信息多数是通过信号分子来传递的。信号分子是同细胞受体结合并传递信息的分子。

　　信号分子本身并不直接作为信息，它的基本功能只是提供一个正确的构型及与受体结合的能力。

　　■ 信号分子的类型及信号传导方式

　　有三种类型的信号分子（图5-3）。

图5-3 三种不同类型的信号分子及其信号传导方式

　　● 激素（hormone）

　　激素是由内分泌细胞（如肾上腺、睾丸、卵巢、胰腺、甲状腺、甲状旁腺和垂体）合成的化学信号分子，一种内分泌细胞基本上只分泌一种激素，参与细胞通讯的激素有三种类型：蛋白与肽类激素、类固醇激素、氨基酸衍生物激素（表5-1）

表5-1 某些激素的性质和功能

名称	合成部位	化学特性	主要作用
肾上腺素	肾上腺	酪氨酸衍生物	提高血压、心律、增强代谢
皮质醇	肾上腺	类固醇	在大多数组织中影响蛋白、糖、 脂的代谢
雌二醇	卵巢	类固醇	诱导和保持雌性副性征
胰高血糖素	胰α细胞	肽	在肝、脂肪细胞刺激葡萄糖合成、糖原断裂、 脂断裂
胰岛素	胰β细胞	蛋白质	刺激肝细胞等葡萄糖吸收、蛋白 质及脂的合成
睾酮	睾丸	类固醇	诱导和保持雄性副性征
甲状腺素	甲状腺	酪氨酸衍生物	刺激多种类型细胞的代谢

　　通过激素传递信息是最广泛的一种信号传导方式，这种通讯方式的距离最远，覆盖整个生物体。在动物中，产生激素的细胞是内分泌细胞，所以将这种通讯称为内分泌信号（endocrine signaling）。

　　● 局部介质（local mediators）

　　局部介质是由各种不同类型的细胞合成并分泌到细胞外液中的信号分子，它只能作用于周围的细胞。通常将这种信号传导称为旁分泌信号（paracrine signaling），以便与自分泌信号相区别。有时这种信号分子也作用于分泌细胞本身， 如前列腺素（prostaglandin，PG）是由前列腺合成分泌的脂肪酸衍生物（主要是由花生四烯酸合成的）， 它不仅能够控制邻近细胞的活性，也能作用于合成前列腺素细胞自身，通常将由自身合成的信号分子作用于自身的现象称为自分泌信号（autocrine signaling）。［医学 教育网 搜集整理］

　　● 神经递质 （neurotransmitters）

　　神经递质是由神经末梢释放出来的小分子物质，是神经元与靶细胞之间的化学信使。由于神经递质是神经细胞分泌的，所以这种信号又称为神经信号（neuronal signaling）。

　　■ 依赖于细胞接触的信号传导

　　通过细胞的接触，包括通过细胞粘着分子介导的细胞间粘着、细胞与细胞外基质的粘着、连接子（植物细胞为胞间连丝）介导的信号传导。

　　通过细胞接触进行的通讯中，信号分子位于细胞质膜上，两个细胞通过信号分子的接触传递信息（图5-4）。

图5-4 通过分泌的信号分子通讯与通过膜结合的信号分子通讯的比较

细胞通讯中，由信号传导细胞送出的信号分子必须被靶细胞接收才能触发靶细胞的应答，接收信息的分子称为受体（ receptor），信号分子则被称为配体（ligand）。

　　■ 受体存在的部位

　　信号分子识别并结合的受体通常位于细胞质膜或细胞内，所以有两类受体：

　　● 表面受体（surface receptor）

　　于细胞质膜上的称为表面受体（surface receptor）

　　● 细胞内受体（intracellular receptor）

　　位于胞质溶胶、核基质中的受体称为细胞内受体（intracellular receptor）。

　　表面受体主要是同大的信号分子或小的亲水性的信号分子作用，传递信息。而细胞内受体主要是同脂溶性的小信号分子作用（图5-5）。医学教育网

图5-5 细胞表面受体与细胞内受体

　　■ 细胞内受体

　　细胞内受体通常有两个不同的结构域， 一个是与DNA结合的结构域， 另一个是激活基因转录的N端结构域。此外有两个结合位点，一个是与配体结合的位点，位于C末端，另一个是与抑制蛋白结合的位点，在没有与配体结合时，则由抑制蛋白抑制了受体与DNA的结合，若是有相应的配体，则释放出抑制蛋白（图5-6）。

图5-6 细胞内受体的结构示意图

　　细胞内受体在接受脂溶性的信号分子并与之结合形成受体-配体复合物后就成为转录促进因子，作用于特异的基因调控序列，启动基因的转录和表达（图5-7）。

图5-7 糖皮质激素受体激活

（a） 类固醇激素通过扩散穿过细胞质膜；（b）激素分子与胞质溶胶中的受体结合；（c）抑制蛋白与受体脱离，露出与DNA结合和激活基因转录的位点；（d）被激活的复合物进入细胞核；（e）与DNA增强子区结合；（f）促进受激素调节的基因转录。

　　■ 细胞表面受体

　　位于细胞质膜上的受体称为表面受体，主要有三种类型∶离子通道偶联受体（ion-channel linked receptor）、G-蛋白偶联受体（G-protein linked receptor）、酶联受体（enzyme-linked receptor）（图5-8）。

图5-8 三种类型的细胞表面受体

（a）离子通道偶联受体；（b）G-蛋白偶联受体；（c）酶联受体。

　　● 离子通道偶联受体（ino-channel linked receptor）

　　具有离子通道作用的细胞质膜受体称为离子通道受体， 这种受体见于可兴奋细胞间的突触信号传导，产生一种电效应（图5-9）。

图5-9 离子通道偶联受体与信号传导

　　①动作电位到达突触末端，引起暂时性的去极化；②去极化作用打开了电位门控钙离子通道，导致钙离子进入突触球；③Ca2+浓度提高诱导分离的含神经递质分泌泡的分泌，释放神经递质；④Ca2+引起储存小泡分泌释放神经递质；⑤分泌的神经递质分子经扩散到达突触后细胞的表面受体；⑥神经递质与受体的结合，改变受体的性质；⑦离子通道开放，离子得以进入突触后细胞；⑧突触后细胞中产生动作电位。

　　烟碱样乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor）是研究得比较清楚的离子通道偶联受体，它存在于脊椎动物骨骼肌细胞以及某些鱼的放电器官细胞的质膜上，受体与乙酰胆碱结合，引起Na+通道的开放，Na+流入靶细胞，使得质膜去极化并引起细胞的收缩。

　　如何通过实验分离烟碱样乙酰胆碱受体并证明烟碱样乙酰胆碱受体具有通道偶联受体的作用？

　　● G-蛋白偶联受体（G-protein linked receptor）

　　这类受体的种类很多，在结构上都很相似∶都是一条多肽链，并且有7次α螺旋跨膜区（图5-10）。这种7次跨膜受体蛋白的超家族包括视紫红质（脊椎动物眼中的光激活光受体蛋白），以及脊椎动物鼻中的嗅觉受体。

图5-10 G-蛋白偶联受体的结构

　　每一种G-蛋白偶联受体都有7个α螺旋的跨膜区，信号分子与受体的细胞外部分结合，并引起受体的细胞内部分激活相邻的G-蛋白。

　　● 酶联受体（enzyme linked receptor）

　　这种受体蛋白既是受体又是酶，一旦被配体激活即具有酶活性并将信号放大，又称催化受体（catalytic receptor）。按照受体的细胞内结构域是否具有酶活性将此类受体分为两大类：缺少细胞内催化活性的酶联受体和具有细胞内催化活性的酶联受体。

　　举例说明什么是缺少细胞内催化活性的酶联受体和具有细胞内催化活性的酶联受体？

　　非酪氨酸激酶受体（nonreceptor tyrosine kinases）就是缺少细胞内催化活性的酶联受体。虽然这种受体本身没有酶的结构域，但实际效果与具有酶结构域的受体是一样的（图5-11）。

图5-11 缺少细胞内酪氨酸激酶的酶联受体

　　受体与酪氨酸激酶是分开的，配体与受体结合后，受体形成二聚体，两个酪氨酸激酶分别与受体结合并被激活。

　　细胞内具有催化结构域的酶联受体有很多种类型， 包括具有鸟苷环化酶活性受体和磷酸酶的活性（图5-12a，b）受体、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性受体或酪氨酸蛋白激酶的活性的受体（图5-12c，d）。

图5-12 具有细胞内催化结构域的酶联受体

即Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
　　与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
　　western blotting 实验试剂
　　1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺
　　将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。
　　小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
　　2）4×Tris•Cl/SDS, pH8.8,
　　在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH至8.8, 补加H2O至体积500ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。
　　3）4×Tris•Cl/SDS, pH6.8,
　　在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH至6.8, 补加H2O至体积100ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再加入0.4g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。
　　4）4×SDS电泳缓冲液
　　Tris base 24.2 g
　　Glycerin 115.3 g
　　20%SDS 20 ml
　　加水至总体积1000ml。
　　应用时稀释4倍即为1×SDS电泳缓冲液(Tris 0.05M, Glycerin 0.38M, SDS 0.1%)。
　　5）TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
　　TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺的聚合。
　　6）10%过硫酸铵
　　过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量10%(w/v)的贮存液并保存于4℃。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。
　　步骤
　　1）按厂商的使用指南用两块干净的玻璃，平板和0.75mm垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上。
　　2）按表7.1配制分离胶液体并脱气，然后加入10％的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌混匀。
　　表7.1 聚丙烯酰胺分离胶的配制
　　试剂成分 配制不同浓度分离胶所需试剂(ml)
　　5% 8% 10% 12% 15%
　　Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.50
　　4×Tris•Cl/SDS, pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
　　H2O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.75
　　10%过硫酸铵 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
　　TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
　　按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5％的凝胶可用于60～200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离，10％用于16～70kDa，15％用于12～45kDa。
　　3）用一根巴斯德吸管立即将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边缘加入于玻璃平板夹层中，至凝胶约5cm高为止。样品体积少于10μl不需灌制积层胶。
　　4）用另一根已斯德吸管，先从一边的垫片，再从另一边垫片往夹层的液面顶部缓缓加入一层水饱和异丁醇（厚约1cm）。让凝胶在室温聚合30min。
　　聚合后，可见在顶层异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线，胶的聚合失败往往问题在于过硫酸按或TEMED，或两者都有。
　　5)倾去顶层的异丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面,尽量用吸水纸吸干。
　　6)按表7.2配制积层胶液体，用吸管将液体沿一条垫片加入到玻璃平板夹层，直至夹层的顶部。
　　表7.2 聚丙烯酰胺积层胶的配制
　　GEL%（3.9%) Total (10.05ml)
　　Acry:Bis(30:0.8) 1.30 ml
　　4×Tris•Cl/SDS, pH6.8 2.50 ml
　　H2O 6.10 ml
　　10%过硫酸铵 0.05 ml
　　TEMED 0.01 ml
　　7)将0.75mm厚的梳子插入夹层的积层胶液体中，必要时，再补加积层胶液体充盈剩余空间。让积层胶室温聚合30min。
　　8)在具螺口盖的微量离心管中，用2×SDS加样缓冲液按1:1(v/v)稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸5-10min。如样品是蛋白质沉淀物，加入50～100μl 1×SDS加样缓冲液溶解之，并同样在100℃煮沸5-10min。按供应商的使用指南用2×SDS加样缓冲液溶解蛋白质分子量标准混合物。
　　对于0.3cm宽的加样孔，推荐加样体积以不超过20μl 为宜。用考马斯亮蓝染色法显迹，成分很复杂的蛋白质混合物需加25～50μg，而样品中只有一种或不多的几种蛋白的话，只需1～10μg蛋白量。采用银染显迹时，样品用量可减小10～100倍（按样品的复杂程度在小于20μl的体积溶有0.01～0.5ng蛋白样品不等）。
　　2×SDS加样缓冲液(loading buffer)配制：
　　成　分 体积 (ml)
　　0.5M Tris•Cl (pH6.8) 12.5
　　20%SDS 11.5
　　Glycerin 10
　　2% Blue-Bromo-phenol 2.5
　　β-mercaptoethanol * 5.0
　　加H2O至总体积50 ml，分装
　　*β-mercaptoethanol 在临用前加入。
　　9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔。取出梳子后，以1×SDS电泳电泳缓冲液冲洗加祥孔，并以此缓冲液充满之。
　　10）按厂商指南将凝胶板固定到电泳装置的上缓冲液室（上槽），同时往下缓冲液室（下槽）加入推荐量的1×SDS电泳缓冲液。
　　11）将固定于上槽的凝胶板放入下槽中，并往上槽加入部分电泳缓冲液至刚好淹没凝胶的加样孔。
　　12）用带平嘴针头的50μl注射器将同样浓度的蛋白质样品等体积加入到样品孔中，小心加样使样品在孔的底部成一薄层，对照孔加入蛋白质分子量标准样品，如有空置的加样孔，须加等体积的空白1×SDS样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。
　　13)再往上槽加入余下的1×SDS电泳缓冲液。此操作缓慢小心，以防冲起样品孔中的样品。
　　14）连接电源，对于0.75mm厚的垂直板电泳，先在60V下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，再将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。
　　15）关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液。连同上槽一起将凝胶夹层取出。
　　16）将凝胶定位以便识别加样的顺序，将凝胶板从上槽解离出来，放在一叠吸水纸或纸巾上。
　　17）小心将封边的垫片抽出一半，并以此为杠杆橇起上面的玻璃平板，使凝胶暴露出来。
　　18）小心从下面的玻璃平板上移出凝胶，在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序，接着就可进行蛋白质的检测。
　　19)转膜
　　将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。（100V，1小时）要放于4℃。
　　1. For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).
　　2. For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent (250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).
　　3. For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or 500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).
　　4. For Proteins larger than 250kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).
　　Add transfer (or CAPS) buffer to the transfer unit according to manufacturer1s directions. Transfer over night with a setting of 20V / 40 mA or for 3 hours at 70V/160 mA. The transfer process needs to take place under cold temperatures to prevent the gel from sticking to the membrane. This can be accomplished either by using a water cooling core in the transfer unit or placing the entire unit at 4?. Please follow the manufacturer1s recommendations
　　20)、清洗
　　将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。摇床摇动。（这步忘了！）
　　21)、封闭
　　1. Remove the blot from the transfer apparatus or staining tray and immediately place into blocking buffer (1% BSA, 10mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20).
　　2. Incubate the blot for 1 hour at 37℃, 2 hours at room temperature, or overnight at 4℃.
　　22)、一抗孵育
　　一抗用TBST1:1000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1.5小时，(或4℃过夜)摇床摇动。
　　Probe with primary antibody in TTBS/1% NFDM for 1 hr. at room temperature. Primary antibody should be diluted as specified on product data sheets. If these values are not available, use the following guidelines for initial experiments: apply antisera or ascites at 1:500 to 1:5,000, apply purified primary antibodies at a concentration of 1 ug/ml.
　　23)、清洗
　　将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。
　　24)、二抗孵育
　　二抗用TBST1:8000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1小时，摇床摇动。
　　25)、清洗
　　同22，之后，用1X TBS在清洗2次，每次5分钟，以洗去膜上的Tween 20，因为它可以阻碍底物的沉积。
　　26)、显色
　　按如下配方配制显色液：
　　1mL水+1滴（大约50微升）试剂A(之后混匀)+1滴试剂B+1滴试剂C
　　将硝酸纤维素膜放入其中孵育，一旦显色，立即放入去离子水中终止反应。

目的基因的亚克隆

外源DNA片段末端性质	连接要求	连接结果
不对称粘性末端	两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率	载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。
对称性粘性末端	线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理	载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。
平端	要求高浓度的DNA和连接酶	载体与外源DNA连接处的限制酶切位点消失；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；非重组克隆的背景较高 。

带有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必须克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中,但是在连接反应时,外源DNA和质粒都可能发生环化,也有可能形成串联寡聚物。因此，必须仔细调整连接反应中两个DNA 的浓度，以便使“正确”连接产物的数量达到最佳水平，此外还常常使用碱性磷酸酶去除5’磷酸基团以抑制载体DNA的自身环化。利用T4 DNA连接酶进行目的DNA片段和载体的体外连接反应，也就是在双链DNA 5’磷酸和相邻的3’羟基之间形成新的共价键。如载体的两条链都带有5’磷酸（未脱磷），可形成4个新的磷酸二酯键；如载体DNA已脱磷，则只能形成2个新的磷酸二酯键，此时产生的重组DNA带有两个单链缺口，在导入感受态细胞后可被修复。
（二）T4 DNA连接酶对目的DNA片段和载体连接的一般方案
1．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。
2．10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补足ddH2O 至8μl。
3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴5min后，迅速转入冰浴。
4．加入含ATP的10×Buffer 1μl，T4 DNA连接酶合适单位， 用ddH2O 补至10μl，稍加离心，在适当温度（一般14-16℃水浴）连接8-14hr。
四、连接产物的转化
1.感受态细胞的制备
⑴ 保存于-70℃的DH5α（或其他菌种）用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现（约14-16 hr）。
⑵ 挑取单菌落，接种于2.0ml LB液体培养基中，37℃恒温，250g振荡培养过夜（约12hr）。
⑶ 取0.5ml 过夜培养液，接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2hr。
（注：以下操作均应在冰浴中进行。）
⑷ 将培养液分入两个50ml离心管中，4℃离心，4000g×10min，弃去上清，用冰浴的0.1M MgCl2 25ml悬浮30min。
⑸ 4℃离心,4000g×10min，弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2-甘油溶液1ml悬浮。
⑹ 以100μl/管分装入1.5ml离心管中，-70℃冻存备用。
   注：此法制备感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒DNA产生5×106-2×107个菌落，这样的转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要，制备的感受态细胞可贮存于-70℃，但保存时间过长会使转化效率在一定程度上受到影响，一般三个月以内转化效率无多大改变。
2. 连接产物的转化
⑴ 取100μl贮存于-70℃钙化菌，冰浴化开；
⑵ 加入适量连接产物（一般不超过10μl，轻轻混匀，冰浴20min；
⑶ 于42℃热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；
⑷ 加入LB液体培养基200μl，于37℃缓摇孵育45min；
⑸ 将培养物适量涂于1.5%琼脂LB平板（根据质粒性质添加抗生素或/和X-Gal/IPTG），待胶表面没有液体流动时，37℃温箱倒置培养12-16hr。
五、重组子的筛选
   根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。
六、注意事项
1.    目的DNA片段制备、回收、纯化时，应避免外来DNA污染。
2. 不同厂家生产的T4 DNA连接酶反应条件稍有不同，但其产品说明书上均有最适反应条件，包括对不同末端性质DNA分子连接的T4 DNA连接酶的用量、作用温度、时间等。同时提供有连接酶缓冲液（10×、5×、2×），其中多已含有要求浓度的ATP，应避免高温放置和反复冻融使其分解。
2.    连接产物的转化：细菌细胞经特殊试剂处理后在适当的条件下具有接收外源DNA的能力，因此可将上述连接产物通过热刺激或电脉冲转化感受态细胞，当细菌大量增殖的同时，导入的重组DNA也得到增殖。
3.    制备感受态细胞所用离心管、培养瓶最好经酸碱处理或使用新的，15 lbf/in2高压灭菌20min。
5. 白色菌落中重组质粒内插入片段是否是目的片段需通过鉴定

胶回收 一. 提高胶回收量的办法： 1) 增加电泳时的上样量。 2) 电泳缓冲液用新鲜配制的。 3) 切胶时尽量只切有条带的胶，减小切胶体积：含目的片断很少的胶就不要要了，不然影响回收率。 4) 把切的两块或多块胶融化后，无论多大的体积都用一个管子，转移到同一个柱子上。 5) 溶胶时所加的溶液可多一点，这样更有利于DNA与膜的结合，不过一般不要多余750ul。 6) 胶回收的关键是通过柱子的溶液的盐浓度、酸碱性（电荷）和疏水性使DNA与柱子结合，因此，若电泳缓冲液的PH偏高，可在溶胶液中加入10ul（PH 5.0，3mol/L的 NaAC）；为了使DNA分子更好的拦截在膜上，可以添加30％异丙醇在加热溶解胶后的液体里。 7) 加洗脱液之前，将柱子在室温放置几分钟（大约需10分钟），以使乙醇充分挥发。 8) 最后少加些洗脱液，尽量减少回收体积，一般用30-50μl洗脱液洗脱（不能太少，否则无法浸湿膜反而不利于洗脱）；洗脱液滴在膜中央，以充分洗脱结合在膜上的DNA。 9) 可以在加入洗脱液之后，可以在55度水浴5分钟或放在50度水浴10分钟以上再洗脱，或用封口膜密封4度过夜，第二天再离心回收，效果不错。 10) 将离心后的洗脱液加回吸附柱，再次离心。 二. 几种PCR 产物回收的详方法和步骤 1) 普通胶回收 如果要胶回收，最好还是用试剂盒，方便，回收率也略高，实在要手工回收，可以切胶后加入3倍体积TE，水浴熔化后，酚、酚／氯仿抽提干净，乙醇沉淀即可。另外好像还有冷冻法，没作过，不是很清楚。 2) 从低熔点凝胶回收DNA 纯化DNA片段 加与凝胶体积相等的TE（10mmol/l Tris-HCl pH8.0，0.1mmol/l EDTA），置65℃水浴5分钟保温，使凝胶完全溶解。待放至室温，加等量酚（TE饱和，TE封在上层，取下层酚），轻轻混匀（不用混匀），12000rpm，3分钟离心。反复1-2次。取上层液，加0.1体积3mol/L醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，进行乙醇沉淀。将纯化的DNA加适量TE溶解，测定含量，备用（可用于目的基因结构分析，探针制备等）。 3) 扩增特异性好的PCR回收 如果PCR扩增特异性好，只是简单的PCR产物纯化回收，可以在PCR产物中加入50ug／ml 的蛋白酶K，37度1h，酚／氯仿抽提一次，氯仿抽提一次，上清加入0.1体积的醋酸钠，2.5体积的无水乙醇沉淀回收。 三. 不需胶回收就可直接连接的方法 1) 低温冷冻析出法 跑电泳时用低熔点的agarose胶，跑到一定时候，将目的条带所在的那一段胶切下，尽量切干净，让核酸直接暴露在胶的表面，并且，把底下没有脱氧核酸的那点胶也尽量切掉，然后放入1.5ml EP管中，然后放在负75度冰箱中10－30分钟，接着1，300rpm离心5－10分钟，取10ul上清，加入连接体系中。将其余的液体也吸出，储存在另一个管子中，做好标记，放在－20度备用。 2) 酶切后的直接连接 在你酶切后可以直接的加入连接酶和另外的片断进行连接是可以筛选出连接好的片断的. 四、一些注意事项 1.电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理干净，刀片最好洗净灭菌，总之一句话就是保证切下的带没有外源DNA污染。 2.切胶是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收。为了减少胶的体积，可以用相对比较薄的胶来做，只要够点样即可，也可采用薄而宽的梳子来跑胶。 3.关于防护，在一般有机玻璃后就足够了，戴上防护面具以保护眼睛，如果你戴树脂眼镜就可以了。 4.琼脂糖对回收率有一定影响，如果琼脂糖较多，可以增加溶胶液，保证体系盐浓度。影响回收率的因素主要是柱子填料必须在适宜的缓冲环境中（如果用柱子的话）。对于小于１００ｂｐ的片段回收，可加至30%异丙醇。 5.如果是用PAGE回收，用水或TE溶解，枪头捣碎，过夜浸泡，即可。当然你要将100bp在胶中位置定好切下。已标记的探针用X片，未标记的用EB。 6.选用回收效率较高的柱子，比如进口的Qiaquick spin column。 7.参照分子克隆用低熔点胶回收。除低熔点凝胶回收法外，如用一般凝胶可用透析带短暂电泳，离心管低部加玻璃棉，高速离心等方法回收DNA片段。 附注： 1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素： 1)DNA分子大小 迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密的电泳快（超螺旋>线性DNA） 2) 琼脂糖浓度：logU=logU0 Krt 胶浓度，U为迁移率，U0 为DNA的自由电泳迁移率，t为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA Agarose： 0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb. 3)DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。当条件变化时，情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。 4)所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm 5)碱基组成与温度：一般影响不大4 -30 ℃ 6)嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中) 7)电泳缓冲液 （0.5×TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE，1×TPE（均含EDTA pH8.0）。 2．溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽量减少台面污染。 3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。

质粒提取
1质粒提取原理
2质粒小量提取之细菌的培养及收集
3质粒小量提取之煮沸法
4质粒小量提取之碱裂解法
5质粒的大量提取之细菌的培养及收集
6质粒大量提取之煮沸裂解法
7质粒大量提取之碱裂解法
8质粒大量提取之 SDS裂解法
9质粒DNA纯化
10质粒提取常见问题解析

质粒提取原理

       质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
       从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。
       在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型 。
       质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA； 松弛开环的OC构型； 超螺旋的SC构型。 由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。 道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边； 道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间 。

质粒小量提取之细菌的培养及收集

试验准备：
1、 LB液体培养基(Luria-Bertani) ：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。
2、 LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌。
3、 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20℃保存备用。
试验步骤：
将含有质粒菌种接种在LB固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24h。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。

质粒小量提取之煮沸法

试验原理：
煮沸法是根据Holmex和Quigley(1985)的方法改进而成的。在基因工程中， DNA 分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的 DNA 序列，在一定的条件下切断双链 DNA 。限制性内切酶的作用效率是受多方面因素影响的，如反应温度，缓冲体系，离子种类与浓度， DNA 的纯度和甲基化程度等。对 DNA 进行酶切时，首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切，应选用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用的缓冲液。 DNA 的纯度对于酶切的效果的影响也很大，因为蛋白质。酚。氯仿。 SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。 # a( B7 N# l" G% k0 E
        琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化 DNA 片段的常规方法。利用低浓度的荧光嵌入染料 - 溴化乙锭进行染色，可确定 DNA 在凝胶中的位置。如有必要，还可以从凝胶中 回收 DNA 条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为 200bp 至近 50kbp 的 DNA 。长度 100kb 或更大的 DNA ，可以通过电场方向呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。
       在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。 DNA 分子在凝胶缓冲液（一般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。 DNA 分子迁移的速率受分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。
实验准备：
70% 乙醇（ -20 ℃）及无水乙醇（ -20 ℃）
2、 STET 缓冲液（ pH8.0 ）（ 8% 蔗糖， 0.5%Triton, 50mmol/L EDTA,,10mmol/L Tris ）
2 1.2M 氯化钠 )
4、 TE 缓冲液（ 10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA ）
5、 STET:0.1mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0），5％Triton X－10（其他同碱裂解法）
试验步骤：
1、 无菌操作台上取1.5ml培养菌体置于离心管（Eppendorf管）中，微量离心机上10000rpm离心1min，或者以 4000rpm离心5－10min，弃上清液，倒扣于干净的吸水纸上吸干。
2、 将菌体沉淀悬浮于350μl STET缓冲溶液中, 涡旋使其混匀。
3、 加入25μl新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制), 涡旋振荡大概3秒钟。5
4、 将eppendorf管放入沸水浴中,40秒后立即取出。
5、 微量离心机上以4℃，12000rmp离心10min。 用无菌牙签从eppendorf管中挑去细菌碎片。
7、 在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置５min。
8、 微量离心机上以4℃，12 000rmp离心５min，回收核酸沉淀。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。（可参考裂解法中的做法）。
/ w( W: U' h# W/ Z5 \0 G9、 加入1ml７０％乙醇，以4℃，12 000rmp离心２min。轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，有时沉淀块 贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，室温下放置，直至乙醇挥发完全，管内无可见的液体为止（大概需要２－５min）。
10、 用50μl无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸，稍加振荡即可，贮存于-20℃。
注意事项：
1、大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
2、 添加溶菌酶一定要有限度,浓度过高细菌裂解效果反而不好，有时不同溶菌酶也能溶菌。 提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。 试验步骤中的细菌沉淀和核酸沉淀中去除上清液时，一定要除尽。
5、 用 70% 的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分谨慎，防止将核酸同洗液一起倒掉。 实验过程中所用的器皿和吸头都要进行高压灭菌。
7、 当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒DNA时，建议不用煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶Ａ，在Mg2+存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可被降解。 若要避免这一问题可以在用70％乙醇洗涤一步前增加一步用酚/氯仿进行抽提。
8、 如果要通过限酶切割反应来分析DNA，可取１μlDNA溶液加到另一个含８μl水的微量离心管内，加１μl 10x限制 酶缓冲液和１单位所需限制酶，在适宜温度温育１－２h。将剩余的DNA贮存于－20℃。通过凝胶电泳分析经 限制酸消化的DNA片段。如果小量制备的DNA不被限制酶切开，很有可能在收获细菌的步骤中未能很好地去除所有上清液体。这种情况下，可用酚：氯仿抽提DNA终产物，然后用乙醇重新沉淀DNA，通常，用5－10倍过量的酶（特别是并不昂贵的酶）在100-200μl 体积中进行消化，可以克服限制酶切割反应遇到切割反应遇到的困难。消化后， 加0. 1 体积3mol/L乙酸钠（pH5.2)和２倍体积乙醇沉淀DNA

质粒小量提取之碱裂解法

试验原理：
碱裂解法是较常用的提取的方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。十二烷基磺进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒DNA和染色体DNA，两种DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液pH值，使溶液pH值恢复较低的近中性水平时， 质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体DNA则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒DNA。碱裂解法提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析等。
试验准备：
1、 溶液Ｉ:pH8.0 GET缓冲液（50mmol葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris－HCl）；溶液Ｉ可成批配制，在(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15min，贮存于４℃。葡萄糖的作用是使悬浮后的大肠杆菌不会很快沉积到管子的底部，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2＋ 和Mg2 ＋等二价金属离子的螯合剂，在溶液I中加入EDTA，是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉。从而起到抑制DNase; 对DNA的降解和抑制微生物生长的作用。
2、 溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(内含1％的SDS)，这个用的时候需现配。要新配置溶液Ⅱ是为了避免NaOH接触空气中的CO2而减弱了碱性。NaOH是最佳溶解细胞的试剂。不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会在瞬间溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化。用不新鲜的0.4 N NaOH，即便有SDS也无法有效溶解大肠杆菌。SDS是离子型表面活性剂。它主要作用是：a溶解细胞膜上的脂质与蛋白，从而破坏细胞膜。b解聚细胞中的核蛋白。c能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在接下来的提取过程必须把它去除干净，以便下一步试验的更好进行。
溶液Ⅲ：pH4.8乙酸钾溶液（60ml 5mol/L KAc，11.5ml冰醋酸，28.5mlH2O）；该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L. pH4.8的乙酸钾溶液是为了把抽提液的pH调至中性，从而使变性的质粒DNA复性，且稳定存在。溶液III加入后的沉淀实际上是K+置换了SDS中的Na+形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚，使得沉淀更完全。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的盐形式复合物。异丙醇；采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1％左右，小分子所需PEG浓度高达20％。无水乙醇：乙醇可以以任意比和水相混溶，而DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，同时乙醇与核酸不起化学反应，因此是理想的沉淀剂。加入的乙醇后，乙醇会夺去DNA周围的水分子，DNA失水聚合。一般实验中，是!
加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。也可改用95％乙醇来替代无水乙醇。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30min即可。但因为使用异丙醇时常把盐沉淀下来，所以较多的还是使用乙醇。
8 pH8.0TE缓冲液；10mmol/LTris－HCl，1mmol/L EDTA，其中含 RNA酶 20ug/ml。在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。
试验步骤:
无菌操作台上,取1.5ml培养菌体置于离心管（Eppendorf管）中，微量离心机上以10000rpm离心1min，或者以4000rpm离心5－10min，弃上清液，离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。沉淀中加100μl用冰预冷的溶液I，加或不加入少量溶菌酶粉末，充分混合（需要剧烈振荡）。室温下放置10min。
加入200μl溶液 II(新鲜配置)，加盖后轻轻快速颠倒离心管数次混匀（千万不要振荡），冰浴5 min 。
加入150μl预冷溶液III，轻轻颠倒数次混匀（10s），置于冰浴15 min 。
微量离心机上以4℃，12000rpm离心15min，取上清液于另一新Eppendorf管中。
上清夜中加入等体积酚/氯仿（1：1）混匀，微量离心机上以4℃，12000rpm,离心5min。{经验之谈：如果选用
宿主合适的话（如DH5a、XL1-blue等，HB101和BL21则不行），可以不用酚氯仿抽提这一步。用1倍体积的乙醇 沉淀，沉淀中所含的盐和RNA就很少了，完全去除上清液后就可以直接加TE溶解质粒，后续的限制性酶切转化完全没有问题。仅供参考}
小心转上层至一新的离心管弃去中层的蛋白质和下层的有机相。
8、 小心移出上清于一新Eppendorf管中,加入2 /3倍体积异丙醇,混匀, 4℃离心12000g×5min。: 上清夜中加入2倍体积的无水乙醇混匀，室温下放置5min－10min，以12000rpm,离心5min-15min。
9 1.0ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1 ～2次,沉淀在室温下晾干。
小心吸去上清夜，将离心管倒置于一张纸上，使所有的液体流出。再将附着在管壁上的液滴除去。在除去管壁上的液滴时，可以用一次性吸头与真空管相连，用吸头接触液面。但在液体吸出时应当尽量使吸头远离核酸沉淀。自然干燥或者真空抽干到看不到液滴最好。
加入50μlTE缓冲液（PH 8.0 含20μg/mlRNaseA）溶解质粒粗提物，在-20℃保存。
注意事项：
       提取过程应尽量在低温环境中进行，蛋白质的去除以酚/氯仿混合效果最好，可以采取多次抽提尽量将蛋白质除干净，在沉淀DNA 时通常使用冰乙醇，在低温条件下放置可使DNA沉淀完全。同时反应中加入的盐浓度一定要控制好，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钾盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的钾溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。一般情况下都是加入的最终浓度达0.1～0.25mol/L为宜。

新的开始，新的旅程，删除破碎的记忆，割断无聊的情绪，好好学习！