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■ 信号分子（signal molecules）

　　细胞通讯的信息多数是通过信号分子来传递的。信号分子是同细胞受体结合并传递信息的分子。

　　信号分子本身并不直接作为信息，它的基本功能只是提供一个正确的构型及与受体结合的能力。

　　■ 信号分子的类型及信号传导方式

　　有三种类型的信号分子（图5-3）。

图5-3 三种不同类型的信号分子及其信号传导方式

　　● 激素（hormone）

　　激素是由内分泌细胞（如肾上腺、睾丸、卵巢、胰腺、甲状腺、甲状旁腺和垂体）合成的化学信号分子，一种内分泌细胞基本上只分泌一种激素，参与细胞通讯的激素有三种类型：蛋白与肽类激素、类固醇激素、氨基酸衍生物激素（表5-1）

表5-1 某些激素的性质和功能

名称	合成部位	化学特性	主要作用
肾上腺素	肾上腺	酪氨酸衍生物	提高血压、心律、增强代谢
皮质醇	肾上腺	类固醇	在大多数组织中影响蛋白、糖、 脂的代谢
雌二醇	卵巢	类固醇	诱导和保持雌性副性征
胰高血糖素	胰α细胞	肽	在肝、脂肪细胞刺激葡萄糖合成、糖原断裂、 脂断裂
胰岛素	胰β细胞	蛋白质	刺激肝细胞等葡萄糖吸收、蛋白 质及脂的合成
睾酮	睾丸	类固醇	诱导和保持雄性副性征
甲状腺素	甲状腺	酪氨酸衍生物	刺激多种类型细胞的代谢

　　通过激素传递信息是最广泛的一种信号传导方式，这种通讯方式的距离最远，覆盖整个生物体。在动物中，产生激素的细胞是内分泌细胞，所以将这种通讯称为内分泌信号（endocrine signaling）。

　　● 局部介质（local mediators）

　　局部介质是由各种不同类型的细胞合成并分泌到细胞外液中的信号分子，它只能作用于周围的细胞。通常将这种信号传导称为旁分泌信号（paracrine signaling），以便与自分泌信号相区别。有时这种信号分子也作用于分泌细胞本身， 如前列腺素（prostaglandin，PG）是由前列腺合成分泌的脂肪酸衍生物（主要是由花生四烯酸合成的）， 它不仅能够控制邻近细胞的活性，也能作用于合成前列腺素细胞自身，通常将由自身合成的信号分子作用于自身的现象称为自分泌信号（autocrine signaling）。［医学 教育网 搜集整理］

　　● 神经递质 （neurotransmitters）

　　神经递质是由神经末梢释放出来的小分子物质，是神经元与靶细胞之间的化学信使。由于神经递质是神经细胞分泌的，所以这种信号又称为神经信号（neuronal signaling）。

　　■ 依赖于细胞接触的信号传导

　　通过细胞的接触，包括通过细胞粘着分子介导的细胞间粘着、细胞与细胞外基质的粘着、连接子（植物细胞为胞间连丝）介导的信号传导。

　　通过细胞接触进行的通讯中，信号分子位于细胞质膜上，两个细胞通过信号分子的接触传递信息（图5-4）。

图5-4 通过分泌的信号分子通讯与通过膜结合的信号分子通讯的比较

细胞通讯中，由信号传导细胞送出的信号分子必须被靶细胞接收才能触发靶细胞的应答，接收信息的分子称为受体（ receptor），信号分子则被称为配体（ligand）。

　　■ 受体存在的部位

　　信号分子识别并结合的受体通常位于细胞质膜或细胞内，所以有两类受体：

　　● 表面受体（surface receptor）

　　于细胞质膜上的称为表面受体（surface receptor）

　　● 细胞内受体（intracellular receptor）

　　位于胞质溶胶、核基质中的受体称为细胞内受体（intracellular receptor）。

　　表面受体主要是同大的信号分子或小的亲水性的信号分子作用，传递信息。而细胞内受体主要是同脂溶性的小信号分子作用（图5-5）。医学教育网

图5-5 细胞表面受体与细胞内受体

　　■ 细胞内受体

　　细胞内受体通常有两个不同的结构域， 一个是与DNA结合的结构域， 另一个是激活基因转录的N端结构域。此外有两个结合位点，一个是与配体结合的位点，位于C末端，另一个是与抑制蛋白结合的位点，在没有与配体结合时，则由抑制蛋白抑制了受体与DNA的结合，若是有相应的配体，则释放出抑制蛋白（图5-6）。

图5-6 细胞内受体的结构示意图

　　细胞内受体在接受脂溶性的信号分子并与之结合形成受体-配体复合物后就成为转录促进因子，作用于特异的基因调控序列，启动基因的转录和表达（图5-7）。

图5-7 糖皮质激素受体激活

（a） 类固醇激素通过扩散穿过细胞质膜；（b）激素分子与胞质溶胶中的受体结合；（c）抑制蛋白与受体脱离，露出与DNA结合和激活基因转录的位点；（d）被激活的复合物进入细胞核；（e）与DNA增强子区结合；（f）促进受激素调节的基因转录。

　　■ 细胞表面受体

　　位于细胞质膜上的受体称为表面受体，主要有三种类型∶离子通道偶联受体（ion-channel linked receptor）、G-蛋白偶联受体（G-protein linked receptor）、酶联受体（enzyme-linked receptor）（图5-8）。

图5-8 三种类型的细胞表面受体

（a）离子通道偶联受体；（b）G-蛋白偶联受体；（c）酶联受体。

　　● 离子通道偶联受体（ino-channel linked receptor）

　　具有离子通道作用的细胞质膜受体称为离子通道受体， 这种受体见于可兴奋细胞间的突触信号传导，产生一种电效应（图5-9）。

图5-9 离子通道偶联受体与信号传导

　　①动作电位到达突触末端，引起暂时性的去极化；②去极化作用打开了电位门控钙离子通道，导致钙离子进入突触球；③Ca2+浓度提高诱导分离的含神经递质分泌泡的分泌，释放神经递质；④Ca2+引起储存小泡分泌释放神经递质；⑤分泌的神经递质分子经扩散到达突触后细胞的表面受体；⑥神经递质与受体的结合，改变受体的性质；⑦离子通道开放，离子得以进入突触后细胞；⑧突触后细胞中产生动作电位。

　　烟碱样乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor）是研究得比较清楚的离子通道偶联受体，它存在于脊椎动物骨骼肌细胞以及某些鱼的放电器官细胞的质膜上，受体与乙酰胆碱结合，引起Na+通道的开放，Na+流入靶细胞，使得质膜去极化并引起细胞的收缩。

　　如何通过实验分离烟碱样乙酰胆碱受体并证明烟碱样乙酰胆碱受体具有通道偶联受体的作用？

　　● G-蛋白偶联受体（G-protein linked receptor）

　　这类受体的种类很多，在结构上都很相似∶都是一条多肽链，并且有7次α螺旋跨膜区（图5-10）。这种7次跨膜受体蛋白的超家族包括视紫红质（脊椎动物眼中的光激活光受体蛋白），以及脊椎动物鼻中的嗅觉受体。

图5-10 G-蛋白偶联受体的结构

　　每一种G-蛋白偶联受体都有7个α螺旋的跨膜区，信号分子与受体的细胞外部分结合，并引起受体的细胞内部分激活相邻的G-蛋白。

　　● 酶联受体（enzyme linked receptor）

　　这种受体蛋白既是受体又是酶，一旦被配体激活即具有酶活性并将信号放大，又称催化受体（catalytic receptor）。按照受体的细胞内结构域是否具有酶活性将此类受体分为两大类：缺少细胞内催化活性的酶联受体和具有细胞内催化活性的酶联受体。

　　举例说明什么是缺少细胞内催化活性的酶联受体和具有细胞内催化活性的酶联受体？

　　非酪氨酸激酶受体（nonreceptor tyrosine kinases）就是缺少细胞内催化活性的酶联受体。虽然这种受体本身没有酶的结构域，但实际效果与具有酶结构域的受体是一样的（图5-11）。

图5-11 缺少细胞内酪氨酸激酶的酶联受体

　　受体与酪氨酸激酶是分开的，配体与受体结合后，受体形成二聚体，两个酪氨酸激酶分别与受体结合并被激活。

　　细胞内具有催化结构域的酶联受体有很多种类型， 包括具有鸟苷环化酶活性受体和磷酸酶的活性（图5-12a，b）受体、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性受体或酪氨酸蛋白激酶的活性的受体（图5-12c，d）。

图5-12 具有细胞内催化结构域的酶联受体

即Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
　　与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
　　western blotting 实验试剂
　　1）30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺
　　将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌，查证该溶液pH应不大于7.0，置棕色瓶中保存。
　　小心：丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。
　　2）4×Tris•Cl/SDS, pH8.8,
　　在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L)，用1mol/L调节pH至8.8, 补加H2O至体积500ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再加入2g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。
　　3）4×Tris•Cl/SDS, pH6.8,
　　在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L)，用1mol/L调节pH至6.8, 补加H2O至体积100ml。用0.45um滤膜过滤溶液，再加入0.4g SDS[0.4%(w/v)]，于4℃可保存1月。
　　4）4×SDS电泳缓冲液
　　Tris base 24.2 g
　　Glycerin 115.3 g
　　20%SDS 20 ml
　　加水至总体积1000ml。
　　应用时稀释4倍即为1×SDS电泳缓冲液(Tris 0.05M, Glycerin 0.38M, SDS 0.1%)。
　　5）TEMED (N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
　　TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺的聚合。
　　6）10%过硫酸铵
　　过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和亚甲丙烯酰胺聚合所必需的自由基。可用去离子水配制小量10%(w/v)的贮存液并保存于4℃。由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。
　　步骤
　　1）按厂商的使用指南用两块干净的玻璃，平板和0.75mm垫片组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上。
　　2）按表7.1配制分离胶液体并脱气，然后加入10％的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌混匀。
　　表7.1 聚丙烯酰胺分离胶的配制
　　试剂成分 配制不同浓度分离胶所需试剂(ml)
　　5% 8% 10% 12% 15%
　　Acry:Bis (30:0.8) 2.50 4.00 5.00 6.00 7.50
　　4×Tris•Cl/SDS, pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
　　H2O 8.75 7.25 6.25 5.25 3.75
　　10%过硫酸铵 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
　　TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
　　按所需分离的蛋白质分子大小选择合适的丙烯酰胺百分比浓度，一般地，5％的凝胶可用于60～200kDa的SDS变性蛋白质分子的分离，10％用于16～70kDa，15％用于12～45kDa。
　　3）用一根巴斯德吸管立即将分离胶液体沿夹层中一条垫片的边缘加入于玻璃平板夹层中，至凝胶约5cm高为止。样品体积少于10μl不需灌制积层胶。
　　4）用另一根已斯德吸管，先从一边的垫片，再从另一边垫片往夹层的液面顶部缓缓加入一层水饱和异丁醇（厚约1cm）。让凝胶在室温聚合30min。
　　聚合后，可见在顶层异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线，胶的聚合失败往往问题在于过硫酸按或TEMED，或两者都有。
　　5)倾去顶层的异丁醇，并以1×Tris-Cl/SDS, pH8.8缓冲液冲洗凝胶的顶部表面,尽量用吸水纸吸干。
　　6)按表7.2配制积层胶液体，用吸管将液体沿一条垫片加入到玻璃平板夹层，直至夹层的顶部。
　　表7.2 聚丙烯酰胺积层胶的配制
　　GEL%（3.9%) Total (10.05ml)
　　Acry:Bis(30:0.8) 1.30 ml
　　4×Tris•Cl/SDS, pH6.8 2.50 ml
　　H2O 6.10 ml
　　10%过硫酸铵 0.05 ml
　　TEMED 0.01 ml
　　7)将0.75mm厚的梳子插入夹层的积层胶液体中，必要时，再补加积层胶液体充盈剩余空间。让积层胶室温聚合30min。
　　8)在具螺口盖的微量离心管中，用2×SDS加样缓冲液按1:1(v/v)稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸5-10min。如样品是蛋白质沉淀物，加入50～100μl 1×SDS加样缓冲液溶解之，并同样在100℃煮沸5-10min。按供应商的使用指南用2×SDS加样缓冲液溶解蛋白质分子量标准混合物。
　　对于0.3cm宽的加样孔，推荐加样体积以不超过20μl 为宜。用考马斯亮蓝染色法显迹，成分很复杂的蛋白质混合物需加25～50μg，而样品中只有一种或不多的几种蛋白的话，只需1～10μg蛋白量。采用银染显迹时，样品用量可减小10～100倍（按样品的复杂程度在小于20μl的体积溶有0.01～0.5ng蛋白样品不等）。
　　2×SDS加样缓冲液(loading buffer)配制：
　　成　分 体积 (ml)
　　0.5M Tris•Cl (pH6.8) 12.5
　　20%SDS 11.5
　　Glycerin 10
　　2% Blue-Bromo-phenol 2.5
　　β-mercaptoethanol * 5.0
　　加H2O至总体积50 ml，分装
　　*β-mercaptoethanol 在临用前加入。
　　9）小心拔出梳子，避免撕裂聚丙烯酰胺凝胶加样孔。取出梳子后，以1×SDS电泳电泳缓冲液冲洗加祥孔，并以此缓冲液充满之。
　　10）按厂商指南将凝胶板固定到电泳装置的上缓冲液室（上槽），同时往下缓冲液室（下槽）加入推荐量的1×SDS电泳缓冲液。
　　11）将固定于上槽的凝胶板放入下槽中，并往上槽加入部分电泳缓冲液至刚好淹没凝胶的加样孔。
　　12）用带平嘴针头的50μl注射器将同样浓度的蛋白质样品等体积加入到样品孔中，小心加样使样品在孔的底部成一薄层，对照孔加入蛋白质分子量标准样品，如有空置的加样孔，须加等体积的空白1×SDS样品缓冲液，以防相邻泳道样品的扩散。
　　13)再往上槽加入余下的1×SDS电泳缓冲液。此操作缓慢小心，以防冲起样品孔中的样品。
　　14）连接电源，对于0.75mm厚的垂直板电泳，先在60V下电泳至溴酚蓝染料从积层胶进入分离胶，再将电压调至120V继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部为止。
　　15）关闭电源并撤去连接的导线，弃去电泳缓冲液。连同上槽一起将凝胶夹层取出。
　　16）将凝胶定位以便识别加样的顺序，将凝胶板从上槽解离出来，放在一叠吸水纸或纸巾上。
　　17）小心将封边的垫片抽出一半，并以此为杠杆橇起上面的玻璃平板，使凝胶暴露出来。
　　18）小心从下面的玻璃平板上移出凝胶，在凝胶的一角切去一小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序，接着就可进行蛋白质的检测。
　　19)转膜
　　将凝胶面与负极相连，硝酸纤维素膜与正极相连。（100V，1小时）要放于4℃。
　　1. For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).
　　2. For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent (250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).
　　3. For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or 500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).
　　4. For Proteins larger than 250kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour and 45 minutes or equivalent (500mAmp for 3.5 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).
　　Add transfer (or CAPS) buffer to the transfer unit according to manufacturer1s directions. Transfer over night with a setting of 20V / 40 mA or for 3 hours at 70V/160 mA. The transfer process needs to take place under cold temperatures to prevent the gel from sticking to the membrane. This can be accomplished either by using a water cooling core in the transfer unit or placing the entire unit at 4?. Please follow the manufacturer1s recommendations
　　20)、清洗
　　将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。摇床摇动。（这步忘了！）
　　21)、封闭
　　1. Remove the blot from the transfer apparatus or staining tray and immediately place into blocking buffer (1% BSA, 10mM Tris pH 7.5, 100mM NaCl, 0.1% Tween 20).
　　2. Incubate the blot for 1 hour at 37℃, 2 hours at room temperature, or overnight at 4℃.
　　22)、一抗孵育
　　一抗用TBST1:1000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1.5小时，(或4℃过夜)摇床摇动。
　　Probe with primary antibody in TTBS/1% NFDM for 1 hr. at room temperature. Primary antibody should be diluted as specified on product data sheets. If these values are not available, use the following guidelines for initial experiments: apply antisera or ascites at 1:500 to 1:5,000, apply purified primary antibodies at a concentration of 1 ug/ml.
　　23)、清洗
　　将硝酸纤维素膜放入1X TBST中清洗3次，每次5分钟。
　　24)、二抗孵育
　　二抗用TBST1:8000稀释，将硝酸纤维素膜放入其中，37℃孵育1小时，摇床摇动。
　　25)、清洗
　　同22，之后，用1X TBS在清洗2次，每次5分钟，以洗去膜上的Tween 20，因为它可以阻碍底物的沉积。
　　26)、显色
　　按如下配方配制显色液：
　　1mL水+1滴（大约50微升）试剂A(之后混匀)+1滴试剂B+1滴试剂C
　　将硝酸纤维素膜放入其中孵育，一旦显色，立即放入去离子水中终止反应。